Täname, et külastasite veebisaiti www.chinacdoe.com.Teie kasutataval brauseri versioonil on piiratud CSS-i tugi.Parima kasutuskogemuse saavutamiseks soovitame kasutada värskendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Seni renderdame saidi jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Kohapealsete võimalustega labor-on-a-chip süsteemid pakuvad potentsiaali kiireks ja täpseks diagnoosimiseks ning on kasulikud piiratud ressurssidega tingimustes, kus biomeditsiiniseadmed ja koolitatud spetsialistid pole saadaval.Siiski jääb suureks väljakutseks hoolduspunktis testimissüsteemi loomine, millel on samaaegselt kõik vajalikud funktsioonid multifunktsionaalseks doseerimiseks, nõudmisel vabastamiseks, usaldusväärseks toimimiseks ja reaktiivide pikaajaliseks säilitamiseks.Siin kirjeldame kangiga käitatavat mikrosõidulüliti tehnoloogiat, mis suudab manipuleerida vedelikega igas suunas, pakkuda täpset ja proportsionaalset reageerimist rakendatud õhurõhule ning jääda stabiilseks äkiliste liikumiste ja vibratsiooni eest.Tehnoloogiale tuginedes kirjeldame ka polümeraasi ahelreaktsiooni süsteemi väljatöötamist, mis ühendab reaktiivi sisestamise, segamise ja reaktsioonifunktsioonid kõik ühes protsessis, mis tagab "proovi vastust välja" toimivuse kõigi 18 patsiendi kliiniliste ninaproovide jaoks. Gripp ja 18 individuaalset kontrolli, fluorestsentsi intensiivsuse ja standardse polümeraasi ahelreaktsiooni heas vastavuses (Pearsoni koefitsiendid > 0,9).Tehnoloogiale tuginedes kirjeldame ka polümeraasi ahelreaktsioonisüsteemi väljatöötamist, mis ühendab reaktiivi sisestamise, segamise ja reaktsioonifunktsioonid kõik ühes protsessis, mis tagab 18 patsiendi kliiniliste ninaproovide "proovi vastust välja" toimivuse. gripiga ja 18 individuaalset kontrolli, fluorestsentsi intensiivsuse ja standardse polümeraasi ahelreaktsiooni heas vastavuses (Pearsoni koefitsiendid > 0,9).Основываясь на этой технологии, мы также описываем разработку системы полимеразной цепной реакции ения реагентов, смешивания и реакции в одном процессе, что обеспечивает выполнение «образец-в-отвене»лехц-в-ответ-вы образцов из носа от 18 пациентов с Грипп и 18 отдельных контролей, в хорошем соответствии интенсивности флуоресценции со стандертной полимей циенты Пирсона> 0,9).Sellele tehnoloogiale tuginedes kirjeldame ka polümeraasi ahelreaktsioonisüsteemi väljatöötamist, mis ühendab süstimise, segamise ja reageerimise funktsioonid ühes protsessis, võimaldades 18 gripihaige kõigi kliiniliste ninaproovide võtmist vastusena.ja 18 individuaalset kontrolli, mis on hästi kooskõlas standardse polümeraasi ahelreaktsiooni fluorestsentsi intensiivsusega (Pearsoni koefitsiendid > 0,9).Sellele tehnoloogiale tuginedes kirjeldame ka polümeraasi ahelreaktsioonisüsteemi väljatöötamist, mis ühendab reaktiivi süstimise, segamise ja reaktsioonifunktsioonid, et analüüsida kõiki kliinilisi ninaproove 18 proovis olevast ninapatsiendi proovist. Gripp ja 18 individuaalset kontrolli, fluorestsentsi intensiivsus on sobitatud hästi standardse polümeraasi ahelreaktsiooniga (Pearsoni koefitsient > 0,9).Kavandatav platvorm tagab biomeditsiinilise analüüsi usaldusväärse automatiseerimise ja võib seega kiirendada mitmete hoolduspunktide testimisseadmete turustamist.
Tekkivad inimhaigused, nagu 2020. aasta COVID-19 pandeemia, mis on nõudnud miljonite inimeste elusid, kujutavad tõsist ohtu ülemaailmsele tervisele ja inimtsivilisatsioonile1.Haiguste varajane, kiire ja täpne avastamine on viiruse leviku tõkestamiseks ja ravitulemuste parandamiseks ülioluline.Diagnostiline põhiökosüsteem, mis põhineb tsentraliseeritud laboritel, kus testiproovid saadetakse haiglatesse või diagnostikakliinikutesse ja mida juhivad spetsialistid, piirab praegu ligi 5,8 miljardi inimese juurdepääsu kogu maailmas, eriti neile, kes elavad piiratud ressurssidega tingimustes.kus puudub kallis biomeditsiiniline aparatuur ja kvalifitseeritud spetsialistid.arstid 2. Seega on tungiv vajadus välja töötada odav ja kasutajasõbralik labori-kiibil süsteem koos hoolduspunkti testimise (POCT) võimalusega, mis suudaks anda arstidele õigeaegset diagnostilist teavet teadlike diagnoosiotsuste tegemiseks. .ja ravi 3.
Maailma Terviseorganisatsiooni (WHO) juhised ütlevad, et ideaalne POCT peaks olema taskukohane, kasutajasõbralik (lihtne kasutada minimaalse koolitusega), täpne (vältige valenegatiivseid või valepositiivseid tulemusi), kiire ja usaldusväärne (pakkuma häid korratavusomadusi) ja tarnitav (võimeline pikaajaliseks säilitamiseks ja lõppkasutajatele kergesti kättesaadav)4.Nende nõuete täitmiseks peavad POCT-süsteemid pakkuma järgmisi funktsioone: mitmekülgne doseerimine, et vähendada käsitsi sekkumist, nõudmisel vabanemine mastaabis reaktiivi transport täpsete katsetulemuste saavutamiseks ja usaldusväärne jõudlus, et taluda keskkonnavibratsiooni.Praegu on kõige laialdasemalt kasutatav POCT-seade külgvooluriba5,6, mis koosneb mitmest poorse nitrotselluloosmembraani kihist, mis suruvad väga väikese koguse proovi ette, reageerides kapillaarjõu toimel eelnevalt immobiliseeritud reagentidega.Kuigi nende eeliseks on madal hind, kasutuslihtsus ja kiired tulemused, saab vooluribapõhiseid POCT-seadmeid kasutada ainult bioloogiliste testide jaoks (nt glükoositestid7,8 ja rasedustestid9,10), ilma et oleks vaja teha mitmeastmelisi analüüse.reaktsioonid (nt mitme reaktiivi laadimine, segamine, multipleksimine).Lisaks ei taga vedeliku liikumist kontrollivad liikumapanevad jõud (st kapillaarjõud) head konsistentsi, eriti partiide vahel, mille tulemuseks on halb reprodutseeritavus11 ja külgvooluribad on eelkõige kasulikud hea tuvastamise jaoks12,13.
Laiendatud tootmisvõimalused mikro- ja nanomõõtmetes on loonud võimalused mikrofluidiliste POCT-seadmete arendamiseks kvantitatiivseteks mõõtmisteks14,15,16,17.Reguleerides liidese 18, 19 omadusi ja kanalite 20, 21, 22 geomeetriat, saab juhtida nende seadmete kapillaarjõudu ja voolukiirust.Kuid nende töökindlus, eriti tugevalt niisutatud vedelike puhul, on tootmisebatäpsuste, materjalidefektide ja keskkonnavibratsiooni tundlikkuse tõttu vastuvõetamatu.Lisaks, kuna vedeliku-gaasi liidesel tekib kapillaarvoog, ei saa lisavoolu sisse tuua, eriti pärast mikrofluidikanali vedelikuga täitmist.Seetõttu tuleb keerukama tuvastamise jaoks läbi viia mitu proovi süstimisetappi24,25.
Mikrofluidiseadmete hulgas on tsentrifugaalsed mikrofluidiseadmed praegu üks parimaid lahendusi POCT26,27 jaoks.Selle ajamimehhanism on kasulik selle poolest, et tõukejõudu saab reguleerida pöörlemiskiirust reguleerides.Puuduseks on aga see, et tsentrifugaaljõud on alati suunatud seadme välisserva poole, mistõttu on keerulisemate analüüside jaoks vajalike mitmeetapiliste reaktsioonide teostamine keeruline.Kuigi multifunktsionaalseks doseerimiseks rakendatakse lisaks tsentrifugaaljõule täiendavaid liikumapanevaid jõude (nt kapillaarid 28, 29 ja paljud teised 30, 31, 32, 33, 34, 35), võib ettenägematu vedeliku ülekanne siiski toimuda, sest need lisajõud on üldjuhul tellimuslikud. suurusjärgus väiksem kui tsentrifugaaljõud, mistõttu need on tõhusad ainult väikestes töövahemikes või pole nõudmisel saadaval vedeliku vabastamisega.Pneumaatiliste manipulatsioonide kaasamine tsentrifugaalsetesse mikrofluidikatesse, nagu tsentrifugaalkineetilised meetodid 36, 37, 38, termopneumaatilised meetodid 39 ja aktiivsed pneumaatilised meetodid 40, on osutunud atraktiivseks alternatiiviks.Kontrafugodünaamilise lähenemise korral on seadmesse integreeritud täiendav õõnsus ja ühendavad mikrokanalid nii väliseks kui ka sisemiseks tegevuseks, kuigi selle pumpamise efektiivsus (vahemikus 75% kuni 90%) sõltub suuresti pumpamistsüklite arvust ja viskoossusest. vedelikust.Termopneumaatilise meetodi puhul on lateksmembraan ja vedeliku ülekandekamber spetsiaalselt ette nähtud sisselaskeava tihendamiseks või taasavamiseks, kui kinni jäänud õhuhulka kuumutatakse või jahutatakse.Kuumutamise/jahutamise seadistus toob aga kaasa aeglase reageerimise probleeme ja piirab selle kasutamist termotundlikes testides (nt polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) amplifikatsioon).Aktiivse pneumaatilise lähenemise abil saavutatakse soovi korral vabastamine ja sissepoole liikumine tänu positiivse rõhu samaaegsele rakendamisele ja suure kiirusega mootorite täpselt sobitatud pöörlemiskiirustele.On ka teisi edukaid lähenemisviise, mis kasutavad ainult pneumaatilisi ajamid (ülerõhk 41, 42 või alarõhk 43) ja tavaliselt suletud klapikonstruktsioone.Pneumaatilises kambris järjestikku survet avaldades pumbatakse vedelikku peristaltiliselt edasi ja normaalselt suletud klapp takistab vedeliku tagasivoolu peristaltika tõttu, teostades nii keerulisi vedeliku toiminguid.Praegu on aga ainult piiratud arv mikrofluiditehnoloogiaid, mis suudavad ühes POCT-seadmes teostada keerulisi vedelikuga seotud toiminguid, sealhulgas multifunktsionaalne doseerimine, nõudmisel vabastamine, usaldusväärne jõudlus, pikaajaline ladustamine, kõrge viskoossusega vedelike käsitsemine, ja kulutõhus tootmine.Kõik korraga.Mitmeastmelise funktsionaalse toimimise puudumine võib olla ka üks põhjusi, miks vaid vähesed kaubanduslikud POCT-tooted, nagu Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat ja Rhonda, on siiani edukalt avatud turule toodud.
Selles artiklis pakume välja pneumaatilise mikrofluidilise ajam, mis põhineb rohelise rõnga mikrolülititehnoloogial (FAST).FAST ühendab korraga kõik vajalikud omadused suure hulga reaktiivide jaoks mikroliitritest milliliitriteni.FAST koosneb elastsetest membraanidest, kangidest ja plokkidest.Ilma õhurõhku rakendamata saab membraane, hoobasid ja klotse tihedalt sulgeda ning sees olevat vedelikku pikka aega säilitada.Kui rakendatakse sobivat survet ja reguleeritakse kangi pikkusele, laieneb diafragma ja surub kangi avatud asendisse, lastes vedelikul läbi pääseda.See võimaldab vedelike multifunktsionaalset mõõtmist kaskaadselt, samaaegselt, järjestikku või valikuliselt.
Oleme välja töötanud PCR-süsteemi, mis kasutab FAST-i, et genereerida vastused proovides A- ja B-gripiviiruste (IAV ja IBV) tuvastamiseks.Saavutasime tuvastamise alumise piiri (LOD) 102 koopiat / ml, meie multipleksanalüüs näitas spetsiifilisust IAV ja IBV suhtes ning võimaldas gripiviiruse patotüpiseerimist.Kliiniliste testide tulemused, milles kasutati 18 patsiendi ja 18 terve inimese nina tampooniproovi, näitavad fluorestsentsi intensiivsuse head vastavust standardse RT-PCR-ga (Pearsoni koefitsiendid > 0,9).Kliiniliste testide tulemused, milles kasutati 18 patsiendi ja 18 terve inimese nina tampooniproovi, näitavad fluorestsentsi intensiivsuse head vastavust standardse RT-PCR-ga (Pearsoni koefitsiendid > 0,9).Результаты клинических испытаний с использованием образца мазка из носа от 18 пациентов и 18 здолеизохпохпоеских ответствие интенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).Kliiniliste uuringute tulemused, milles kasutati 18 patsiendilt ja 18 tervelt isikult võetud nina tampooniproovi, näitavad standardse RT-PCR fluorestsentsi intensiivsuse head kokkulangevust (Pearsoni koefitsiendid > 0,9).0,9）…………………………………………………… Результаты клинических испытаний с использованием образцов назальных мазков от 18 пациентов и 18 пациентов и 18 здпохиххохров соответствие между интенсивностью флуоресценции и стандартной ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).Kliiniliste uuringute tulemused, milles kasutati 18 patsiendi ja 18 terve inimese nina tampooniproove, näitasid head ühtlust fluorestsentsi intensiivsuse ja standardse RT-PCR vahel (Pearsoni koefitsient > 0,9).FAST-POCT seadme hinnanguline materjalikulu on ligikaudu 1 USA dollar (täiendav tabel 1) ja seda saab veelgi vähendada, kasutades suuremahulisi tootmismeetodeid (nt survevalu).Tegelikult on FAST-põhistel POCT-seadmetel kõik vajalikud funktsioonid, mille on andnud WHO, ja need ühilduvad uute biokeemiliste testimismeetoditega, nagu plasma termiline tsükkel44, amplifikatsioonivabad immunoanalüüsid45 ja nanokehade funktsionaliseerimise testid46, mis on POCT-süsteemide selgroog.võimalus.
Joonisel fig.1a on kujutatud FAST-POCT platvormi struktuur, mis koosneb neljast vedelikukambrist: eelhoiukamber, segamiskamber, reaktsioonikamber ja jäätmekamber.Vedeliku voolu reguleerimise võti on FAST-disain (koosneb elastsetest membraanidest, hoobadest ja plokkidest), mis asub eelhoiukambris ja segamiskambris.Pneumaatiliselt käivitatava meetodina pakub FAST-konstruktsioon täpset vedelikuvoolu juhtimist, sealhulgas suletud/avatud lülitamist, mitmekülgset doseerimist, vedeliku vabanemist nõudmisel, töökindlat tööd (nt tundlikkus keskkonna vibratsiooni suhtes) ja pikaajalist säilitamist.FAST-POCT platvorm koosneb neljast kihist: aluskiht, elastne kilekiht, plastkile kiht ja kattekiht, nagu on näidatud suurendatud vaates joonisel 1b (üksikasjalikult näidatud ka lisajoonistel S1 ja S2 ).Kõik kanalid ja vedeliku transpordikambrid (nt eelhoiu- ja reaktsioonikambrid) on põimitud PLA (polüimhappe) substraatidele paksusega 0,2 mm (kõige õhem osa) kuni 5 mm paksuseni.Elastseks kilematerjaliks on 300 µm paksune PDMS, mis oma "õhukese paksuse" ja madala elastsusmooduli (umbes 2,25 MPa47) tõttu õhurõhu rakendamisel kergesti paisub.Polüetüleenkile kiht on valmistatud polüetüleentereftalaadist (PET), mille paksus on 100 µm, et kaitsta elastset kilet õhurõhust tingitud liigse deformatsiooni eest.Vastavalt kambritele on aluskihil kattekihiga (valmistatud PLA-st) ühendatud hoovad vedeliku voolu reguleerimiseks.Elastne kile liimiti tagakihile kahepoolse kleeplindiga (ARseal 90880) ja kaeti plastkilega.Kolm kihti pandi aluspinnale kokku, kasutades kattekihis T-klambri kujundust.T-klambril on kahe jala vahel vahe.Kui klamber sisestati soonde, painutasid kaks jalga veidi, naasid seejärel algsesse olekusse ning sidusid soone läbimisel tihedalt kaane ja tagakülje (täiendav joonis S1).Seejärel ühendatakse neli kihti pistikute abil.
Platvormi skemaatiline diagramm, mis illustreerib FASTi erinevaid funktsionaalseid sektsioone ja funktsioone.b FAST-POCT platvormi suurendatud diagramm.c Foto platvormist USA veeranddollarilise mündi kõrval.
FAST-POCT platvormi töömehhanism on näidatud joonisel 2. Võtmekomponendid on aluskihil olevad klotsid ja kattekihi hinged, mille tulemuseks on interferentsi disain, kui neli kihti on kokku pandud T-kujulise kujuga. .Kui õhurõhku ei rakendata (joonis 2a), põhjustab interferentsliit liigendi paindumise ja deformeerumise ning läbi hoova rakendatakse tihendusjõudu, mis surub elastse kile vastu plokki, ja tihendiõõnes olev vedelik määratakse kindlaks. suletud olekuna.Tuleb märkida, et selles olekus on hoob väljapoole painutatud, nagu on näidatud joonisel fig 2a külgvaates.Õhuga varustamisel (joonis 2b) laieneb elastne membraan väljapoole kaane suunas ja lükkab kangi üles, avades seega pilu kangi ja ploki vahel, et vedelik voolaks järgmisse kambrisse, mis on määratletud kui avatud olek. .Pärast õhurõhu vabastamist võib hoob naasta algsesse asendisse ja jääb hinge elastsuse tõttu pingul.Kangi liigutuste videod on esitatud lisafilmis S1.
A. Skemaatiline diagramm ja fotod suletud kujul.Surve puudumisel surub hoob membraani vastu plokki ja vedelik suletakse.b Heas seisukorras.Surve rakendamisel membraan laieneb ja lükkab kangi üles, nii et kanal avaneb ja vedelik saab voolata.c Määrake kriitilise rõhu iseloomulik suurus.Iseloomulikud mõõtmed hõlmavad kangi pikkust (L), liuguri ja hinge vahelist kaugust (l) ning kangi eendi paksust (t).Fs on tihendusjõud drosselklapi punktis B. q on kangi ühtlaselt jaotunud koormus.Tx* tähistab hingedega hoova poolt välja töötatud pöördemomenti.Kriitiline rõhk on rõhk, mis on vajalik kangi tõstmiseks ja vedeliku voolamiseks.d Kriitilise rõhu ja elemendi suuruse vahelise seose teoreetilised ja eksperimentaalsed tulemused.n = 6 sõltumatut katset viidi läbi ja andmed on näidatud ± standardhälbena.Toorandmed esitatakse töötlemata andmefailidena.
Kiirteoorial põhinev analüütiline mudel on välja töötatud, et analüüsida kriitilise rõhu Pc, mille juures vahe avaneb, sõltuvust geomeetrilistest parameetritest (näiteks L on kangi pikkus, l on kaugus ploki ja rõhu vahel). liigend, S on hoob. Kontaktpind vedelikuga t on kangi eendi paksus, nagu on näidatud joonisel 2c).Nagu on üksikasjalikult kirjeldatud lisamärkustes ja lisajoonisel S3, avaneb vahe, kui \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), kus Fs on pöördemoment \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\), et kõrvaldada interferentsi sobivusega seotud jõud ja põhjustada liigendi paindumist.Eksperimentaalne vastus ja analüütiline mudel näitavad head kokkusobivust (joonis 2d), mis näitab, et kriitiline rõhk Pc suureneb t/l suurenedes ja L vähenedes, mida on lihtne seletada klassikalise talamudeliga, st pöördemoment suureneb t /Liftiga. .Seega näitab meie teoreetiline analüüs selgelt, et kriitilist rõhku saab tõhusalt juhtida hoova pikkuse L ja t/l suhte reguleerimisega, mis annab olulise aluse FAST-POCT platvormi disainimisel.
FAST-POCT platvorm pakub multifunktsionaalset doseerimist (näidatud joonisel 3a koos sisendi ja katsega), mis on eduka POCT-i kõige olulisem omadus, kus vedelikud võivad voolata mis tahes suunas ja mis tahes järjekorras (kaskaad, samaaegne, järjestikune) või valikuline mitme kanaliga. väljastamine .- doseerimisfunktsioon.Joonisel fig.3a(i) on kujutatud kaskaaddoseerimisrežiimi, milles kaks või enam kambrit on kaskaaditud, kasutades plokke erinevate reagentide eraldamiseks ja hooba avatud ja suletud oleku juhtimiseks.Surve rakendamisel voolab vedelik kaskaadi korras ülemisest kambrist alumisse.Tuleb märkida, et kaskaadikambreid saab täita märgkemikaalidega või kuivkemikaalidega, näiteks lüofiliseeritud pulbritega.Joonisel 3a(i) kujutatud katses voolab punane tint ülemisest kambrist koos sinise värvipulbriga (vasksulfaat) teise kambrisse ja muutub alumisse kambrisse jõudes tumesiniseks.See näitab ka pumbatava vedeliku kontrollrõhku.Samamoodi, kui üks hoob on ühendatud kahe kambriga, muutub see samaaegseks süstimisrežiimiks, nagu on näidatud joonisel fig.3a(ii), kus vedelikku saab rõhu rakendamisel ühtlaselt jaotada kahe või enama kambri vahel.Kuna kriitiline rõhk sõltub hoova pikkusest, saab hoova pikkust reguleerida, et saavutada järjestikune sissepritsemuster, nagu on näidatud joonisel fig.3a(iii).Kambriga B ühendati pikk hoob (kriitilise rõhuga Pc_long) ja lühike hoob (kriitilise rõhuga Pc_short > Pc_long) ühendati kambriga A. Kuna rakendati rõhku P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), oli ainult punane vedelik võib voolata kambrisse B ja kui rõhk tõsteti väärtuseni P2 (> Pc_short), võib sinine vedelik voolata kambrisse A. See järjestikune süstimisrežiim kehtib erinevate vedelike puhul, mis kanduvad järjestikku nendega seotud kambritesse, mis on eduka POCT jaoks ülioluline seade.Kambriga B ühendati pikk hoob (kriitilise rõhuga Pc_long) ja lühike hoob (kriitilise rõhuga Pc_short > Pc_long) ühendati kambriga A. Kuna rakendati rõhku P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), oli ainult punane vedelik võib voolata kambrisse B ja kui rõhk tõsteti väärtuseni P2 (> Pc_short), võib sinine vedelik voolata kambrisse A. See järjestikune süstimisrežiim kehtib erinevate vedelike puhul, mis kanduvad järjestikku nendega seotud kambritesse, mis on eduka POCT jaoks ülioluline seade.Длинный рычаг (с критическим давлением Pc_long) был соединен с камерой B, а короткий рычаг P. критическим_long соединен с камерой A. При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) только жидкость, выделенная красным может камеру b, иога давение ыо уеличено до p2 (> pc_short), синя са применяетс к к к кing уешной poct.Kambriga B ühendati pikk hoob (kriitilise rõhuga Pc_long) ja lühike hoob (kriitilise rõhuga Pc_short > Pc_long) ühendati kambriga A. Kui rakendatakse survet P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), tõstetakse esile ainult vedelik punane võib voolata kambrisse B ja kui rõhk on tõstetud väärtuseni P2 (> Pc_short), võib sinine vedelik voolata kambrisse A. Seda järjestikust sissepritserežiimi rakendatakse erinevatele vedelikele, mis kantakse järjestikku vastavatesse kambritesse, mis on kriitilise tähtsusega. eduka POCT jaoks.seade. Длинный рычаг (критическое давление Pc_long) соединен с камерой B, а короткий рычаг (критическое давлеское давлеское давлесронение Pc A.Pikk õlg (kriitiline rõhk Pc_long) on ühendatud kambriga B ja lühike õlg (kriitiline rõhk Pc_short > Pc_long) on ühendatud kambriga A.При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) в камеру B может поступать только красная жидкость, а при увениячоts> в камеру A может поступать синяя жидкость.Kui rakendatakse survet P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), pääseb kambrisse B ainult punane vedelik ja kui rõhk on tõstetud väärtusele P2 (> Pc_short), võib kambrisse A siseneda sinine vedelik. See järjestikune süstimisrežiim sobib erinevaid vedelikke vastavatesse kambritesse, mis on POCT-seadme edukaks tööks kriitilise tähtsusega.Joonisel 3a(iv) on näidatud selektiivse sissepritse režiim, kus põhikambril oli lühike (kriitilise rõhuga Pc_short) ja pikk hoob (kriitilise rõhuga Pc_long < Pc_short), mis olid lisaks ühendatud kambriga A ja kambriga B. teise õhukanalisse, mis on ühendatud kambriga B. Vedeliku ülekandmiseks kambrisse A rakendati seadmele samaaegselt survet P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) ja P2 (P2 > P1) koos P1 + P2 > Pc_short.Joonisel 3a(iv) on näidatud selektiivse sissepritse režiim, kus põhikambril oli lühike (kriitilise rõhuga Pc_short) ja pikk hoob (kriitilise rõhuga Pc_long < Pc_short), mis olid lisaks ühendatud kambriga A ja kambriga B. teise õhukanalisse, mis on ühendatud kambriga B. Vedeliku ülekandmiseks kambrisse A rakendati seadmele samaaegselt survet P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) ja P2 (P2 > P1) koos P1 + P2 > Pc_short.Joonisel fig.3а(iv) показан режим селективного впрыска, при котором основная камера имела короткий (с критическим давлерским давлерским давлерским) Pc ритическим давлением Pc_long < Pc_short), которые дополнительно соединялись с камерой A и камерой B соответственно.Joonisel 3a (iv) on näidatud selektiivsissepritse režiim, milles põhikambril oli lühike (kriitilise rõhuga Pc_short) ja pikk hoob (kriitilise rõhuga Pc_long < Pc_short), mis olid lisaks ühendatud vastavalt kambriga A ja kambriga B.к другому воздушному каналу, соединенному с камерой B. Чтобы сначала передать жидкость в камеру A., к устрой вление P1 (Tk_pikk < P1 < Pc_lühike) и P2 (P2 > P1), где P1 + P2 > Pc_lühike.teise õhukanalisse, mis on ühendatud kambriga B. Vedeliku esmaseks ülekandmiseks kambrisse A rakendati seadmele samaaegselt rõhku P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) ja P2 (P2 > P1), kus P1 + P2 > Pc_short. 3а (iv) показан режим селективive нный стержень (с критичесим давением pc_long <pc_short), соединенные с камерой a га кр р р р о о о о р р, р р р р р р р р р р р р р р р р р р р р ко р оо ро о ро ко ро ио р. воз. подключенному к комнате B.3a(iv) näitab selektiivset sissepritserežiimi, kui põhikambril on lühike vars (kriitiline rõhk Pc_short) ja pikk vars (kriitiline rõhk Pc_long < Pc_short), mis on ühendatud vastavalt kambriga A ja kambriga B ning lisaks veel ühele õhukanalile, ühendatud ruumiga B.Seega takistab P2 vedeliku sisenemist kambrisse B;vahepeal ületas kogurõhk P1 + P2 kriitilist rõhku, et aktiveerida kambriga A ühendatud lühem hoob, et vedelik saaks voolata kambrisse A. Kui kamber B oli vaja täita, peame rakendama ainult P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) põhikambris, et aktiveerida pikk hoob ja lasta vedelikul voolata kambrisse B. Ajavahemikus t = 3 s kuni 9 s on selgelt näha, et vedelik kambris A püsis konstantsena, samas kui kambris suurenes. B, kui rakendati rõhku P1.vahepeal ületas kogurõhk P1 + P2 kriitilist rõhku, et aktiveerida kambriga A ühendatud lühem hoob, et vedelik saaks voolata kambrisse A. Kui kamber B oli vaja täita, peame rakendama ainult P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) põhikambris, et aktiveerida pikk hoob ja lasta vedelikul voolata kambrisse B. Ajavahemikus t = 3 s kuni 9 s on selgelt näha, et vedelik kambris A püsis konstantsena, samas kui kambris suurenes. B, kui rakendati rõhku P1.Между тем, общее давление P1 + P2 превысило критическое давление, чтобы активировать более короткий, рымоткий, рычоный чтобы позволить жидкости течь в камеру A. Затем, когда требуется заполнить камеру B, нам нужно
a Multifunktsionaalse määramise illustratsioon, st (i) kaskaadne, (ii) samaaegne, (iii) järjestikune ja (iv) selektiivne määramine.Kõverad kujutavad nende nelja jaotusrežiimi töövoogu ja parameetreid.b Pikaajalise säilitamise testide tulemused deioniseeritud vees ja etanoolis.n = 5 sõltumatut katset viidi läbi ja andmed on näidatud kui ± sd c.Stabiilsustesti demonstratsioonid, kui FAST-seade ja kapillaarklapi (CV) seade olid (i) staatilises ja (ii) vibreerivas olekus.(iii) Helitugevus versus aeg FAST- ja CV-seadmete jaoks erinevatel nurksagedustel.d Testitulemuste avaldamine nõudmisel (i) FAST seadme ja (ii) CV seadme jaoks.iii) vahelduva rõhu režiimi kasutavate FAST- ja CV-seadmete helitugevuse ja aja suhe.Kõik skaalaribad, 1 cm.Toorandmed esitatakse töötlemata andmefailidena.
Reaktiivide pikaajaline säilitamine on eduka POCT-seadme teine oluline omadus, mis võimaldab koolitamata töötajatel käsitleda mitut reaktiivi.Kuigi paljud tehnoloogiad on näidanud oma potentsiaali pikaajaliseks säilitamiseks (nt 35 mikrodosaatorit, 48 blisterpakendit ja 49 pulgapakki), on pakendi mahutamiseks vaja spetsiaalset vastuvõtukambrit, mis suurendab kulusid ja keerukust;lisaks ei võimalda need säilitusmehhanismid nõudmisel väljastamist ja põhjustavad reaktiivide raiskamist pakendis olevate jääkide tõttu.Pikaajalist ladustamisvõimalust kontrolliti kiirendatud eluea testiga, kasutades CNC-ga töödeldud PMMA materjali selle kerge kareduse ja gaasi läbilaskvuse vastupidavuse tõttu (täiendav joonis S5).Katseseade täideti deioniseeritud vee (deioniseeritud vesi) ja 70% etanooliga (simuleerides lenduvaid reagente) temperatuuril 65 °C 9 päeva jooksul.Nii deioniseeritud vett kui ka etanooli säilitati alumiiniumfooliumiga, et blokeerida juurdepääs ülalt.Reaalaja ekvivalendi arvutamiseks kasutati kirjanduses esitatud Arrheniuse võrrandit ja läbitungimise aktiveerimise energiat50,51.Joonisel fig.Joonisel 3b on näidatud keskmised kaalukaotuse tulemused 5 proovi kohta, mida hoiti 65 °C juures 9 päeva, mis on võrdne 0,30% deioniseeritud vee ja 0,72% 70% etanooliga 2 aasta jooksul temperatuuril 23 °C.
Joonisel fig.3c on näidatud vibratsioonikatse.Kuna kapillaarklapp (CV) on olemasolevate POCT28,29 seadmete seas kõige populaarsem vedeliku käitlemise meetod, kasutati võrdluseks 300 µm laiust ja 200 µm sügavust CV-seadet.On näha, et kui mõlemad seadmed jäävad paigale, siis FAST-POCT platvormil olev vedelik tihendub ja CV seadmes olev vedelik lukustub kanali järsu laienemise tõttu, mis vähendab kapillaarjõude.Orbitaalvibraatori nurksageduse suurenedes jääb FAST-POCT platvormi vedelik siiski suletuks, kuid CV-seadmes olev vedelik voolab alumisse kambrisse (vt ka lisafilmi S3).See viitab sellele, et FAST-POCT platvormi deformeeruvad hinged võivad moodulile avaldada tugevat mehaanilist jõudu, et vedelik kambris tihedalt sulgeda.CV-seadmetes aga säilib vedelik tahke-, õhu- ja vedelfaasi tasakaalu tõttu, tekitades ebastabiilsust ning vibratsioon võib tasakaalu rikkuda ja põhjustada ootamatut voolukäitumist.FAST-POCT platvormi eeliseks on see, et see tagab usaldusväärse funktsionaalsuse ja väldib tõrkeid vibratsiooni korral, mis tavaliselt ilmneb tarnimisel ja töötamisel.
Teine FAST-POCT platvormi oluline omadus on selle tellitav väljalase, mis on kvantitatiivse analüüsi põhinõue.Joonisel fig.3d võrdleb FAST-POCT platvormi ja CV-seadme tellitavat väljalaset.Jooniselt fig.3d(iii) näeme, et FAST-seade reageerib kiiresti rõhusignaalile.Kui FAST-POCT platvormile avaldati survet, vedelik voolas, rõhu vabastamisel vool peatus kohe (joonis 3d(i)).Seda toimingut saab seletada hinge kiire elastse tagasitulekuga, mis surub kangi tagasi ploki vastu, sulgedes kambri.Kuid vedelik jätkas CV-seadmes voolamist, mille tulemuseks oli pärast rõhu vabastamist ootamatu vedeliku maht ligikaudu 100 µl (joonis 3d (ii) ja täiendav film S4).Seda saab seletada kapillaaride kinnikiilumise efekti kadumisega CV täielikul niisutamisel pärast esimest süsti.
Võimalus käsitleda erineva märguvuse ja viskoossusega vedelikke ühes ja samas seadmes on POCT-rakenduste jaoks endiselt väljakutse.Halb märgutavus võib põhjustada lekkeid või muud ootamatut voolukäitumist kanalites ning väga viskoossete vedelike valmistamiseks on sageli vaja lisaseadmeid, nagu keerissegisteid, tsentrifuuge ja filtreid 52 .Testisime kriitilise rõhu ja vedeliku omaduste vahelist seost (laia märguvuse ja viskoossusega).Tulemused on näidatud tabelis 1 ja videos S5.Näha on, et kambrisse saab suletada erineva märguvuse ja viskoossusega vedelikke ning surve rakendamisel saab kõrvalkambrisse üle kanda isegi kuni 5500 cP viskoossusega vedelikke, mis võimaldab tuvastada kõrge kontsentratsiooniga proove. viskoossus (st röga, väga viskoosne proov, mida kasutatakse hingamisteede haiguste diagnoosimiseks).
Kombineerides ülaltoodud multifunktsionaalseid jaotusseadmeid, saab välja töötada laias valikus FAST-põhiseid POCT-seadmeid.Näide on toodud joonisel 1. Tehas sisaldab eelhoiukambrit, segamiskambrit, reaktsioonikambrit ja jäätmekambrit.Reaktiive võib eelsäilituskambris hoida pikemat aega ja seejärel segamiskambrisse välja lasta.Õige rõhu korral saab segureagendid valikuliselt üle kanda jäätmekambrisse või reaktsioonikambrisse.
Kuna PCR-i tuvastamine on patogeenide, nagu H1N1 ja COVID-19, tuvastamise kuldstandard ja hõlmab mitut reaktsioonietappi, kasutasime rakendusena PCR-i tuvastamiseks FAST-POCT platvormi.Joonisel fig.4 näitab PCR-i testimise protsessi FAST-POCT platvormi abil.Esiteks pipeteeriti elueeriv reaktiiv, magnetiliste mikrohelmeste reaktiiv, pesulahus A ja pesulahus W vastavalt eelhoiukambritesse E, M, W1 ja W2.RNA adsorptsiooni etapid on näidatud joonisel fig.4a ja on järgmised: (1) rõhu P1 (=0,26 baari) rakendamisel liigub proov kambrisse M ja juhitakse segamiskambrisse.(2) Õhurõhk P2 (= 0,12 baari) antakse läbi pordi A, mis on ühendatud segamiskambri põhjaga.Kuigi mitmed segamismeetodid on näidanud oma potentsiaali vedelike segamisel POCT-platvormidel (nt serpentiinsegamine 53, juhuslik segamine 54 ja partii segamine 55), ei ole nende segamise efektiivsus ja tõhusus endiselt rahuldavad.See kasutab mullidega segamise meetodit, mille puhul õhk juhitakse segamiskambri põhja, et tekitada vedelikus mullid, mille järel võimas keeris võib saavutada täieliku segunemise mõne sekundi jooksul.Viidi läbi mullide segamise katsed ja tulemused on esitatud lisajoonisel S6.On näha, et 0,10 baarise rõhu rakendamisel kulub täielikuks segamiseks umbes 8 sekundit.Rõhu tõstmisel 0,20 baarini saavutatakse täielik segunemine umbes 2 sekundiga.Segamise efektiivsuse arvutamise meetodid on toodud jaotises Meetodid.(3) Kasutage helmeste ekstraheerimiseks rubiidiummagnetit, seejärel suruge P3 (= 0,17 baari) läbi pordi P, et viia reaktiivid jäätmekambrisse.Joonisel fig.4b,c on näidatud pesemisetapid proovist lisandite eemaldamiseks järgmiselt: (1) Pesulahus A kambrist W1 juhitakse survega segamiskambrisse P1.(2) Seejärel tehke mullsegamise protsess.(3) Pesulahus A kantakse jäätmevedeliku kambrisse ja segamiskambris olevad mikrohelmed tõmmatakse magnetiga välja.Pesemine W (joonis 4c) sarnanes pesemisega A (joonis 4b).Tuleb märkida, et iga pesuetapp A ja W viidi läbi kaks korda.joonisel fig 4d on kujutatud elueerimisetappe RNA helmestest elueerimiseks;elueerimise ja segamise sisestamise etapid on samad, mis ülalkirjeldatud RNA adsorptsiooni ja pesemise etapid.Kui elueerimisreagendid viiakse PCR reaktsioonikambrisse rõhkude P3 ja P4 (=0,23 baari) all, saavutatakse kriitiline rõhk, et tihendada PCR reaktsioonikambri õla.Samamoodi aitab P4 rõhk tihendada kanalisatsiooni jäätmekambrisse.Seega jaotati kõik elueerimisreagendid mitmekordsete PCR-reaktsioonide algatamiseks ühtlaselt nelja PCR-i reaktsioonikambri vahel.Ülaltoodud protseduur on esitatud täiendavas filmis S6.
RNA adsorptsiooni etapis viiakse proov sisselaskeavasse M ja süstitakse segamiskambrisse koos eelnevalt säilitatud helmeste lahusega.Pärast segamist ja graanulite eemaldamist jaotatakse reaktiivid jäätmekambrisse.b ja c pesemise etapid, sisestage segamiskambrisse erinevad eelnevalt salvestatud pesureaktiivid ning pärast segamist ja helmeste eemaldamist viige reaktiivid jäätmevedeliku kambrisse.d Elueerimise etapp: pärast elueerimisreaktiivide sisestamist, segamist ja graanulite ekstraheerimist kantakse reaktiivid PCR reaktsioonikambrisse.Kõverad näitavad erinevate etappide töövoogu ja sellega seotud parameetreid.Rõhk on rõhk, mis avaldatakse läbi üksikute kambrite.Maht on vedeliku maht segamiskambris.Kõik skaalaribad on 1 cm.Toorandmed esitatakse töötlemata andmefailidena.
Viidi läbi PCR testimisprotseduur ja lisajoonis S7 kujutab termilisi profiile, sealhulgas 20 minutit pöördtranskriptsiooni aega ja 60 minutit termilist tsükliaega (95 ja 60 ° C), kusjuures üks termiline tsükkel on 90 s (täiendav film S7)..FAST-POCT nõuab ühe termilise tsükli läbimiseks vähem aega (90 sekundit) kui tavaline RT-PCR (180 sekundit ühe termotsükli jaoks).Seda saab seletada mikro-PCR reaktsioonikambri suure pindala ja mahu suhtega ning madala termilise inertsiga.Kambri pind on 96,6 mm2 ja kambri maht 25 mm3, mis teeb pinna ja mahu suhteks ligikaudu 3,86.Nagu on näha lisajoonisel S10, on meie platvormi PCR-testiala tagapaneelil soon, mis muudab PCR-kambri põhja paksuseks 200 µm.Temperatuuriregulaatori küttepinnale on kinnitatud soojust juhtiv elastne padi, mis tagab tiheda kontakti katsekasti tagaküljega.See vähendab platvormi termilist inertsi ja parandab kütte/jahutuse efektiivsust.Termilise tsükli ajal sulab platvormile manustatud parafiin ja voolab PCR-i reaktsioonikambrisse, toimides hermeetikuna, et vältida reaktiivi aurustumist ja keskkonna saastumist (vt lisafilmi S8).
Kõik ülalkirjeldatud PCR-i tuvastamise protsessid olid täielikult automatiseeritud, kasutades eritellimusel valmistatud FAST-POCT instrumenti, mis koosnes programmeeritud rõhureguleerimisseadmest, magnetväljatõmbeseadmest, temperatuuri juhtseadmest ning fluorestsentssignaali püüdmise ja töötlemisseadmest.Pange tähele, et kasutasime RNA eraldamiseks FAST-POCT platvormi ja seejärel ekstraheeritud RNA proove PCR reaktsioonide jaoks, kasutades võrdluseks FAST-POCT süsteemi ja töölaua PCR süsteemi.Tulemused olid peaaegu samad, mis on näidatud lisajoonisel S8.Operaator täidab lihtsa ülesande: viib proovi M-kambrisse ja sisestab platvormi instrumenti.Kvantitatiivsed testitulemused on saadaval umbes 82 minuti pärast.Üksikasjalikku teavet FAST-POCT tööriistade kohta leiate lisajooniselt.C9, C10 ja C11.
A (IAV), B (IBV), C (ICV) ja D (IDV) gripiviiruste põhjustatud gripp on levinud ülemaailmne nähtus.Neist IAV ja IBV põhjustavad kõige raskemaid juhtumeid ja hooajalisi epideemiaid, nakatades 5–15% maailma elanikkonnast, põhjustades 3–5 miljonit rasket haigusjuhtu ja põhjustades 290 000–650 000 surma aastas.Hingamisteede haigused56,57.IAV ja IB varajane diagnoosimine on haigestumuse ja sellega seotud majandusliku koormuse vähendamiseks hädavajalik.Olemasolevatest diagnostikameetoditest peetakse pöördtranskriptaasi polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR) kõige tundlikumaks, spetsiifilisemaks ja täpsemaks (>99%)58,59.Olemasolevatest diagnostikameetoditest peetakse pöördtranskriptaasi polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR) kõige tundlikumaks, spetsiifilisemaks ja täpsemaks (>99%)58,59.Среди доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой ительной, специфичной и точной (> 99%)58,59.Olemasolevatest diagnostikameetoditest peetakse pöördtranskriptaasi polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR) kõige tundlikumaks, spetsiifilisemaks ja täpsemaks (> 99%)58,59. Из доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой тельной, специфичной и точной (>99%)58,59.Olemasolevatest diagnostikameetoditest peetakse pöördtranskriptaasi polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR) kõige tundlikumaks, spetsiifilisemaks ja täpsemaks (>99%)58,59.Traditsioonilised RT-PCR meetodid nõuavad aga vedeliku korduvat pipeteerimist, segamist, väljastamist ja ülekandmist, mis piirab nende kasutamist professionaalide poolt piiratud ressurssidega tingimustes.Siin kasutati FAST-POCT platvormi vastavalt IAV ja IBV PCR tuvastamiseks, et saada nende alumine avastamispiir (LOD).Lisaks on IAV ja IBV multipleksitud, et eristada erinevaid patotüüpe liikide lõikes, pakkudes paljutõotavat platvormi geneetiliseks analüüsiks ja võimet haigust täpselt ravida.
Joonisel fig.5a on näidatud HAV PCR testimise tulemused, kasutades proovina 150 µl puhastatud viiruse RNA-d.Joonisel fig.5a(i) näitab, et HAV kontsentratsioonil 106 koopiat/ml võib fluorestsentsi intensiivsus (ΔRn) ulatuda 0,830-ni ja kui kontsentratsiooni vähendada 102 koopiani/ml, võib ΔRn siiski jõuda 0,365-ni, mis vastab sellest kõrgemale. tühja negatiivse kontrollrühma (0,002), ligikaudu 100 korda suurem.Kuuel sõltumatul katsel põhineva kvantifitseerimise jaoks koostati lineaarne kalibreerimiskõver IAV logaritmi kontsentratsiooni ja tsükliläve (Ct) vahel (joonis 5a(ii)), R2 = 0,993, vahemikus 102-106 koopiat/ml.tulemused on hästi kooskõlas tavapäraste RT-PCR meetoditega.Joonisel fig.5a(iii) näitab testitulemuste fluorestseeruvaid kujutisi pärast FAST-POCT platvormi 40 tsüklit.Leidsime, et FAST-POCT platvorm suudab tuvastada HAV-i kuni 102 koopiat ml kohta.Traditsioonilisel meetodil ei ole aga Ct väärtust 102 koopiat/ml, mistõttu selle LOD on umbes 103 koopiat/ml.Eeldasime, et selle põhjuseks võib olla mullide segamise kõrge efektiivsus.PCR-testi katsed viidi läbi puhastatud IAV RNA-ga, et hinnata erinevaid segamismeetodeid, sealhulgas loksutamist (sama segamismeetod nagu tavalises RT-PCR-operatsioonis), viaali segamist (see meetod, 3 s 0,12 baari juures) ja segamiseta kontrollrühmana. ..Tulemused leiate lisajoonisel S12.On näha, et kõrgema RNA kontsentratsiooni korral (106 koopiat/ml) on erinevate segamismeetodite Ct väärtused peaaegu samad, mis mullidega segamisel.Kui RNA kontsentratsioon langes 102 koopiani/ml, ei olnud loksutatud segul ja kontrollidel Ct väärtusi, samas kui mullsegu meetod andis endiselt Ct väärtuse 36,9, mis oli alla Ct läve 38. Tulemused näitavad domineerivat segunemiskarakteristikut. vesiikulid, mida on näidatud ka muus kirjanduses, mis võib samuti selgitada, miks FAST-POCT platvormi tundlikkus on veidi kõrgem kui tavalisel RT-PCR-il.Joonisel fig.5b näitab puhastatud IBV RNA proovide PCR analüüsi tulemusi vahemikus 101 kuni 106 koopiat/ml.Tulemused olid sarnased IAV testiga, saavutades R2 = 0,994 ja LOD 102 koopiat/ml.
A-gripiviiruse (IAV) PCR-analüüs IAV kontsentratsioonidega vahemikus 106 kuni 101 koopiat/ml, kasutades negatiivse kontrollina TE puhvrit (NC).(i) Reaalajas fluorestsentsi kõver.(ii) Lineaarne kalibreerimiskõver logaritmilise IAV RNA kontsentratsiooni ja tsükli läve (Ct) vahel FAST ja tavapäraste testimismeetodite puhul.(iii) IAV FAST-POCT fluorestsentspilt pärast 40 tsüklit.b, B-gripiviiruse (IBV) PCR tuvastamine (i) reaalajas fluorestsentsspektriga.(ii) Lineaarne kalibreerimiskõver ja (iii) FAST-POCT IBV fluorestsentskujutis pärast 40 tsüklit.FAST-POCT platvormi kasutava IAV ja IBV tuvastamise alumine piir (LOD) oli 102 koopiat/ml, mis on madalam kui tavapärastel meetoditel (103 koopiat/ml).c IAV ja IBV mitmiktesti tulemused.GAPDH-d kasutati positiivse kontrollina ja TE puhvrit kasutati negatiivse kontrollina, et vältida võimalikku saastumist ja tausta võimendamist.Eristada saab nelja erinevat proovitüüpi: (1) ainult GAPDH-ga negatiivsed proovid (IAV-/IBV-);(2) IAV-infektsioon (IAV+/IBV-) IAV ja GAPDH-ga;(3) IBV-nakkus (IAV-/IBV+) IBV ja GAPDH-ga;(4) IAV/IBV infektsioon (IAV+/IBV+) IAV, IBV ja GAPDH-ga.Punktiirjoon tähistab läve joont.n = 6 bioloogiliselt sõltumatut katset viidi läbi, andmed on näidatud ± standardhälbena.Toorandmed esitatakse töötlemata andmefailidena.
Joonisel fig.5c näitab IAV/IBV multipleksimistesti tulemusi.Siin kasutati puhastatud RNA asemel proovilahusena viiruslüsaati ning FAST-POCT platvormi nelja erinevasse reaktsioonikambrisse lisati neli praimerit IAV, IBV, GAPDH (positiivne kontroll) ja TE puhvri (negatiivne kontroll) jaoks.Siin kasutatakse positiivseid ja negatiivseid kontrolle, et vältida võimalikku saastumist ja tausta paranemist.Testid jagati nelja rühma: (1) GAPDH-negatiivsed proovid ("IAV-/IBV-");(2) IAV-ga nakatunud (IAV+/IBV-) versus IAV ja GAPDH;(3) IBV-.nakatunud (“IAV-”) -/IBV+”) IBV ja GAPDH;(4) IAV/IBV (“IAV+/IBV+”) nakkus IAV, IBV ja GAPDH-ga.Joonisel fig.5c näitab, et negatiivsete proovide kasutamisel oli positiivse kontrollkambri fluorestsentsi intensiivsus ΔRn 0, 860 ning IAV ja IBV ΔRn oli sarnane negatiivse kontrolliga (0, 002).IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ ja IAV+/IBV+ rühmade puhul näitasid IAV/GAPDH, IBV/GAPDH ja IAV/IBV/GAPDH kaamerad vastavalt olulist fluorestsentsi intensiivsust, samas kui teised kaamerad näitasid isegi taustal fluorestsentsi intensiivsust. tase 40 pärast termotsüklit.Ülaltoodud testide põhjal näitas FAST-POCT platvorm silmapaistvat spetsiifilisust ja võimaldas meil samaaegselt patotüpiseerida erinevaid gripiviiruseid.
FAST-POCT kliinilise rakendatavuse kinnitamiseks testisime 36 kliinilist proovi (nina tampooniproovid) IB patsientidelt (n = 18) ja mitte-IB kontrollidelt (n = 18) (joonis 6a).Patsiendi teave on esitatud täiendavas tabelis 3. IB-nakkuse staatus kinnitati sõltumatult ja uuringuprotokolli kiitis heaks Zhejiangi ülikooli esimene sidushaigla (Hangzhou, Zhejiang).Iga patsientide valim jaotati kahte kategooriasse.Ühte töödeldi kasutades FAST-POCT ja teist töödeldi lauaarvuti PCR-süsteemi (SLAN-96P, Hiina) abil.Mõlemas testis kasutatakse samu puhastus- ja tuvastamiskomplekte.Joonisel fig.6b on näidatud FAST-POCT ja tavapärase pöördtranskriptsiooni PCR (RT-PCR) tulemused.Võrdlesime fluorestsentsi intensiivsust (FAST-POCT) -log2 (Ct), kus Ct on tavapärase RT-PCR tsükli lävi.Nende kahe meetodi vahel oli hea kokkulepe.FAST-POCT ja RT-PCR näitasid tugevat positiivset korrelatsiooni Pearsoni suhte (r) väärtusega 0,90 (joonis 6b).Seejärel hindasime FAST-POCTi diagnostilist täpsust.Positiivsete ja negatiivsete proovide fluorestsentsi intensiivsuse (FL) jaotused esitati sõltumatu analüütilise mõõdikuna (joonis 6c).FL väärtused olid IB-patsientidel oluliselt kõrgemad kui kontrollrühmadel (****P = 3,31 × 10-19; kahesuunaline t-test) (joonis 6d).Järgmisena joonistati IBV vastuvõtja tööomaduste (ROC) kõverad.Leidsime, et diagnostiline täpsus oli väga hea, kõvera alune pindala oli 1 (joonis 6e).Pange tähele, et COVID-19 tõttu Hiinas kohustusliku maskide tellimise tõttu alates 2020. aastast ei ole me IBD-ga patsiente tuvastanud, seega olid kõik positiivsed kliinilised proovid (st nina tampooniproovid) ainult IBV jaoks.
Kliinilise uuringu ülesehitus.FAST-POCT platvormi ja tavapärase RT-PCR abil analüüsiti kokku 36 proovi, sealhulgas 18 patsiendi proovi ja 18 mittegripikontrolli.b Hinnake FAST-POCT PCR ja tavapärase RT-PCR vahelist analüütilist kooskõla.Tulemused olid positiivses korrelatsioonis (Pearson r = 0,90).c Fluorestsentsi intensiivsuse tasemed 18 IB patsiendil ja 18 kontrollil.d IB-patsientidel (+) olid FL väärtused oluliselt kõrgemad kui kontrollrühmas (-) (****P = 3,31 × 10-19; kaheosaline t-test; n = 36).Iga ruudukujulise graafiku puhul tähistab keskel olev must marker mediaani ning kasti alumine ja ülemine joon tähistavad vastavalt 25. ja 75. protsentiili.Vurrud ulatuvad minimaalse ja maksimaalse andmepunktini, mida ei peeta kõrvalekalleteks.e ROC kõver.Punktiirjoon d tähistab ROC analüüsi põhjal hinnatud läviväärtust.IBV AUC on 1. Toorandmed esitatakse töötlemata andmefailidena.
Selles artiklis tutvustame FAST-i, millel on ideaalse POCT jaoks vajalikud omadused.Meie tehnoloogia eeliste hulka kuuluvad: (1) mitmekülgne doseerimine (kaskaad, samaaegne, järjestikune ja selektiivne), vabastamine nõudmisel (kiire ja proportsionaalne rakendatud rõhu vabastamine) ja töökindel töö (vibratsioon 150 kraadi juures) (2) pikaajaline ladustamine (2 aastat kiirendatud testimist, kaalulangus umbes 0,3%);(3) võime töötada laia märguvuse ja viskoossusega vedelikega (viskoossus kuni 5500 cP);(4) Ökonoomne (FAST-POCT PCR seadme hinnanguline materjalikulu on ligikaudu 1 USA dollar).Kombineerides multifunktsionaalseid dosaatoreid, demonstreeriti ja rakendati integreeritud FAST-POCT platvormi A- ja B-gripiviiruste PCR tuvastamiseks.FAST-POCT võtab aega vaid 82 minutit.Kliinilised testid 36 nina tampooniprooviga näitasid fluorestsentsi intensiivsuse head vastavust standardse RT-PCR-ga (Pearsoni koefitsiendid > 0,9).Kliinilised testid 36 nina tampooniprooviga näitasid fluorestsentsi intensiivsuse head vastavust standardse RT-PCR-ga (Pearsoni koefitsiendid > 0,9).Клинические тесты с 36 образцами мазков из носа показали хорошее соответствие интенсивности (коэффициенты Пирсона > 0,9).Kliinilised testid 36 nina tampooniprooviga näitasid head kokkulangevust standardse RT-PCR fluorestsentsi intensiivsusega (Pearsoni koefitsiendid > 0,9). RT-PCR Клинические испытания 36 образцов мазков из носа показали хорошее совпадение интенсивности фотенсивности флуоресц ЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).36 nina tampooniproovi kliiniline testimine näitas fluorestsentsi intensiivsuse head kokkulangevust standardse RT-PCR-ga (Pearsoni koefitsient > 0,9).Paralleelselt selle tööga on mitmesugused esilekerkivad biokeemilised meetodid (nt plasma termiline tsükkel, amplifikatsioonivabad immunoanalüüsid ja nanokehade funktsionaliseerimise testid) näidanud oma potentsiaali POCT-s.Täielikult integreeritud ja tugeva POCT-platvormi puudumise tõttu nõuavad need meetodid aga paratamatult eraldi eeltöötlusprotseduure (nt RNA eraldamine44, inkubeerimine45 ja pesemine46), mis täiendab praegust tööd nende meetoditega täiustatud POCT-funktsioonide rakendamiseks. nõutavad parameetrid.vastusena toomise väljundi jõudlus.Kuigi selles töös on FAST-klapi aktiveerimiseks kasutatav õhupump piisavalt väike, et seda saaks integreerida lauaseadmesse (joonis S9, S10), tarbib see siiski märkimisväärselt energiat ja tekitab müra.Põhimõtteliselt saab väiksema kujuga pneumaatilisi pumbasid asendada muude vahenditega, näiteks elektromagnetilise jõu või sõrmede abil.Täiendavad täiustused võivad hõlmata näiteks komplektide kohandamist erinevate ja spetsiifiliste biokeemiliste analüüside jaoks, kasutades uusi tuvastamismeetodeid, mis ei vaja kütte-/jahutussüsteeme, pakkudes seega PCR-rakenduste jaoks tööriistavaba POCT-platvormi.Usume, et arvestades, et FAST platvorm pakub võimalust vedelikega manipuleerimiseks, usume, et pakutud FAST-tehnoloogia pakub potentsiaali luua ühine platvorm mitte ainult biomeditsiinilisteks testideks, vaid ka keskkonnaseireks, toidukvaliteedi testimiseks, materjalide ja ravimite sünteesiks. ..
Inimese nina tampooniproovide kogumise ja kasutamise on heaks kiitnud Zhejiangi ülikooli esimese sidushaigla eetikakomitee (IIT20220330B).Koguti 36 nina tampooniproovi, mis hõlmasid 16 alla 30-aastast täiskasvanut, 7 üle 40-aastast täiskasvanut ja 19 meest, 17 naist.Koguti 36 nina tampooniproovi, mis hõlmasid 16 alla 30-aastast täiskasvanut, 7 üle 40-aastast täiskasvanut ja 19 meest, 17 naist.Было собрано 36 образцов мазков из носа, в которых приняли участие 16 взрослых < 30 лет, 7 взрослых, 409 взрослых 17 женщин.16-lt alla 30-aastaselt täiskasvanult, 7-lt üle 40-aastaselt täiskasvanult, 19 mehelt ja 17 naiselt koguti 36 ninatampooniproovi..Demograafilised andmed on esitatud täiendavas tabelis 3. Kõigilt osalejatelt saadi teadlik nõusolek.Kõiki osalejaid kahtlustati gripis ja testiti vabatahtlikult ilma hüvitiseta.
FAST põhi ja kaas on valmistatud polüpiimhappest (PLA) ja prinditud Ender 3 Pro 3D-printeriga (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.).Kahepoolne teip osteti ettevõttelt Adhesives Research, Inc. mudel 90880. 100 µm paksune PET-kile osteti firmalt McMaster-Carr.Nii liim kui ka PET-kile lõigati Silhouette America, Inc. lõikuriga Silhouette Cameo 2. Elastne kile on valmistatud PDMS-materjalist survevalu abil.Esiteks lõigati lasersüsteemi abil 200 µm paksune PET-raam ja liimiti 3 mm paksusele PMMA-lehele, kasutades 100 µm kahepoolset kleeplinti.Seejärel valati vormi PDMS-i eelkäija (Sylgard 184; osa A: osa B = 10:1, Dow Corning) ja liigse PDMS-i eemaldamiseks kasutati klaaspulka.Pärast 3-tunnist kõvenemist temperatuuril 70 °C saab 300 μm paksuse PDMS-kile vormilt maha koorida.
Fotod mitmekülgseks levitamiseks, nõudmisel avaldamiseks ja usaldusväärseks jõudluseks on tehtud kiire kaameraga (Sony AX700 1000 kaadrit sekundis).Usaldusväärsuse testis kasutatud orbitaalloksuti osteti ettevõttelt SCILOGEX (SCI-O180).Õhurõhku genereerib õhukompressor ja rõhu väärtuse reguleerimiseks kasutatakse mitmeid digitaalseid täppisrõhuregulaatoreid.Voolukäitumise testimise protsess on järgmine.Testseadmesse süstiti etteantud kogus vedelikku ja voolu käitumise salvestamiseks kasutati kiirkaamerat.Seejärel võeti fikseeritud aegadel voolukäitumise videotest pildid ja allesjäänud ala arvutati Image-Pro Plus tarkvara abil, mis seejärel korrutati helitugevuse arvutamiseks kaamera sügavusega.Voolu käitumise testimise süsteemi üksikasjad leiate lisajoonisel S4.
Süstige viaali segamisseadmesse 50 µl mikrohelmeid ja 100 µl deioniseeritud vett.Segajõudlusega fotod tehti kiirkaameraga iga 0,1 sekundi järel rõhkudel 0,1 baari, 0,15 baari ja 0,2 baari.Piksliteavet segamisprotsessi ajal saab nendelt piltidelt fototöötlustarkvara (Photoshop CS6) abil.Ja segamise efektiivsust saab saavutada järgmise võrrandiga 53.
kus M on segamise efektiivsus, N on proovi pikslite koguarv ning ci ja \(\bar{c}\) on normaliseeritud ja eeldatav normaliseeritud kontsentratsioon.Segamise efektiivsus on vahemikus 0 (0%, segamata) kuni 1 (100%, täielikult segatud).Tulemused on näidatud lisajoonisel S6.
Reaalajas RT-PCR komplekt IAV ja IBV jaoks, sealhulgas IAV ja IBV RNA proovid (kat. nr RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, Hiina), Tris-EDTA puhver (TE puhver nr B541019 , Sangon Biotech, Hiina), Positive Control RNA puhastuskomplekt (osa nr Z-ME-0010, Liferiver, Hiina) ja GAPDH lahus (osa nr M591101, Sangon Biotech, Hiina) on kaubanduslikult saadaval.RNA puhastuskomplekt sisaldab sidumispuhvrit, pesu A, pesu W, eluenti, magnetilisi mikrohelmeid ja akrüülkandjat.IAV ja IBV reaalajas RT-PCR komplektid sisaldavad IFVA nukleiinhappe PCR tuvastamise segu ja RT-PCR ensüümi.Lisage 6 µl AcrylCarrieri ja 20 µl magnethelmeid 500 µl sidumispuhvri lahusele, loksutage korralikult ja valmistage seejärel bead'i lahus.Lisage pesudele A ja W 21 ml etanooli, loksutage korralikult, et saada vastavalt pesu A ja W lahused.Seejärel lisati 1 µl TE lahusele 18 µl fluorestseeruvat PCR segu IFVA nukleiinhappega ja 1 µl RT-PCR ensüümi, loksutati ja tsentrifuugiti mitu sekundit, saades 20 µl IAV ja IBV praimereid.
Järgige järgmist RNA puhastamise protseduuri: (1) RNA adsorptsioon.Pipeteerige 526 µl pelletite lahust 1,5 ml tsentrifuugi tuubi ja lisage 150 µl proovi, seejärel raputage katsutit käsitsi 10 korda üles-alla.Viige 676 µl segu afiinsuskolonni ja tsentrifuugige 1,88 x 104 g juures 60 sekundit.Järgnevad äravoolud visatakse ära.(2) Pesemise esimene etapp.Lisage afiinsuskolonni 500 µl pesulahust A, tsentrifuugige 1,88 x 104 g juures 40 sekundit ja visake kasutatud lahus ära.Seda pesemisprotsessi korrati kaks korda.(3) pesemise teine etapp.Lisage afiinsuskolonni 500 µl pesulahust W, tsentrifuugige 1,88 × 104 g juures 15 sekundit ja visake kasutatud lahus ära.Seda pesemisprotsessi korrati kaks korda.(4) Elueerimine.Lisage 200 µl eluaati afiinsuskolonni ja tsentrifuugige 1,88 x 104 g juures 2 minutit.(5) RT-PCR: eluaat süstiti 20 μl praimeri lahusesse PCR-tuubis, seejärel asetati tuub RT-PCR-protsessi läbiviimiseks reaalajas PCR-i testimisseadmesse (SLAN-96P).Kogu tuvastamisprotsess võtab umbes 140 minutit (20 minutit RNA puhastamiseks ja 120 minutit PCR tuvastamiseks).
Eelnevalt lisati 526 µl helmeste lahust, 1000 µl pesulahust A, 1000 µl pesulahust W, 200 µl eluaati ja 20 µl praimeri lahust ning säilitati kambrites M, W1, W2, E ja PCR tuvastamiskambrites.Platvormi kokkupanek.Seejärel pipeteeriti 150 µl proovi kambrisse M ja FAST-POCT platvorm sisestati täiendaval joonisel S9 näidatud katseinstrumendile.Umbes 82 minuti pärast olid testi tulemused saadaval.
Kui pole märgitud teisiti, esitatakse kõik testitulemused keskmisena ± SD pärast vähemalt kuut kordust, kasutades ainult FAST-POCT platvormi ja bioloogiliselt sõltumatuid proove.Analüüsist ei jäetud välja andmeid.Katsed ei ole juhuslikud.Teadlased ei olnud katse ajal grupiülesannete suhtes pimedad.
Lisateavet uuringu kavandamise kohta leiate selle artikliga seotud loodusuuringute aruande kokkuvõttest.
Selle uuringu tulemusi toetavad andmed on saadaval täiendavas teabes.See artikkel sisaldab algandmeid.
Chagla, Z. & Madhukar, P. COVID-19 võimendajad rikastes riikides lükkavad vaktsiine kõigi jaoks edasi.Chagla, Z. & Madhukar, P. COVID-19 võimendajad rikastes riikides lükkavad vaktsiine kõigi jaoks edasi.Chagla, Z. ja Madhukar, P. COVID-19 võimendajad rikastes riikides lükkavad vaktsiine kõigi jaoks edasi.Chagla, Z. ja Madhukar, P. COVID-19 revaktsineerimine rikastes riikides lükkab vaktsineerimist kõigi jaoks edasi.Rahvusmeditsiin.27, 1659–1665 (2021).
Faust, L. et al.SARS-CoV-2 testimine madala ja keskmise sissetulekuga riikides: kättesaadavus ja taskukohasus eratervishoiusektoris.mikroobne infektsioon.22, 511–514 (2020).
Maailma Terviseorganisatsioon.Valitud ravitavate sugulisel teel levivate infektsioonide ülemaailmne levimus ja esinemissagedus: ülevaade ja hinnangud.Genf: WHO, WHO/HIV_AIDS/2 https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/66818/WHO_HIV_AIDS_2001.02.pdf (2001).
Fenton, EM et al.Mitu 2D vormitud külgvoolu testriba.ASS rakendus.alma mater.Milano Inter.1, 124–129 (2009).
Schilling, KM et al.Täielikult suletud mikrofluidiline paberipõhine analüüsiseade.anus.Keemiline.84, 1579–1585 (2012).
Lapenter, N. et al.Konkurentsivõimeline paberil põhinev immunokromatograafia koos ensüümiga modifitseeritud elektroodidega võimaldab juhtmevabalt jälgida ja määrata uriini kotiniini elektrokeemilist määra.Sensors 21, 1659 (2021).
Zhu, X. et al.Haiguste biomarkerite kvantifitseerimine mitmekülgse nanosüümiga integreeritud külgmise vedelikuplatvormiga, kasutades glükomeetrit.bioloogiline andur.Bioelektroonika.126, 690–696 (2019).
Boo, S. et al.Raseduse testriba patogeensete bakterite tuvastamiseks, kasutades koncanavaliin A-inimese kooriongonadotropiin-Cu3(PO4)2 hübriidseid nanolilli, magneteraldust ja nutitelefoni lugemist.Mikroarvuti.Ajakiri.185, 464 (2018).